尽管荧光显微镜渗透到细胞和分子生物学的各个领域，但大多数生物学研究者对潜在的光物理现象却知之甚少。了解荧光显微镜的基本原理有助于解决成像问题。此外，荧光显微镜正处于快速发展的状态，几乎每天都会出现新技术、探针和设备。熟悉荧光是利用这些发展成果的先决条件。本文试图提供一个框架来理解荧光团的激发和发射、荧光显微镜的工作方式以及一些可以优化荧光的方法。
多年来，显微镜的许多技术改进都集中在增加感兴趣（信号）和非感兴趣（背景）之间的对比度。荧光显微镜就是一个典型的例子，因为它旨在在黑色背景中仅显示感兴趣的物体。由于其固有的选择性，荧光成像已成为显微镜在生物学研究中的支柱。在过去的几十年里，有机化学家设计了数千种荧光探针，几乎可以标记生物系统的任何方面。可用荧光团的光谱范围很广，可以同时对不同的细胞、亚细胞或分子成分进行成像。
此外，利用固有荧光基因产物（最显著的是绿色荧光蛋白 (GFP) 及其变体）使分子生物学家能够对生物系统的蛋白质成分进行遗传标记，并开创荧光的新时代。最后，激光扫描共聚焦和双光子显微镜的快速发展意味着荧光方法现在提供了一种强大的方法，可以观察三维微观结构，甚至组织深处的结构。出于这些原因，如果不了解荧光的基础知识，就很难进行细胞或分子生物学研究，而且这种趋势正在加速。
01
荧光原理 ✦
1. 激发和发射
荧光显微镜要求目标物体发出荧光。荧光是在吸收通常波长较短的光后几纳秒内发生的光发射。激发波长和发射波长之间的差异称为斯托克斯位移，这是荧光如此强大的关键特性。通过完全过滤激发光而不阻挡发射的荧光，可以只看到发出荧光的物体。这种对比方法优于吸收技术，在吸收技术中，物体被用吸光剂染色。使用吸光染料，对于小物体，吸收的光量与背景只有微乎其微的差别。然而，在荧光中，如果背景没有自发荧光，即使是单个荧光分子也是可见的。
2. 荧光团
利用其荧光特性使用的分子称为荧光团。荧光团分子中最外层电子轨道决定了其作为荧光化合物的效率以及吸收和发射的波长。当荧光化合物在其所谓的“基态”吸收光能（光子）时，分子的电子、振动和旋转状态就会发生变化。吸收的能量有时会将电子移动到平均距离原子核更远的不同轨道。这种向“激发态”的转变发生得非常快（以飞秒为单位）。通常，激发过程也会引发分子振动，其中核间距离随时间变化。所有这些吸收的能量最终都会消失。振动弛豫和荧光发射是荧光团返回其低能基态的主要方式。虽然许多有机物质具有固有荧光（自发荧光），并且少数可用于生物系统中成分的特定标记，但荧光显微镜的典型方法是利用具有一定程度的共轭双键的合成化合物。此类化合物通常具有环状结构（芳香分子），其中的π键可轻松将外轨道电子分布在广阔的区域。这些化合物最适合荧光显微镜，因为激发态和基态轨道之间的能量差异足够小，以至于电磁波谱可见部分中相对低能的光子可用于将电子激发到激发态。通常，分子中的共轭键越多，激发能量要求越低，激发光的波长越长（越红）。发射光沿同一方向移动。此外，以荧光量子产率衡量的效率随着π键数量的增加而增加。在 GFP 中，位于桶状蛋白质中心的 α 螺旋中的三种氨基酸（Ser-Tyr-Gly）的翻译后改变形成具有共轭双键和平面结构的咪唑烷酮环。该环结构是发色团。环结构中的突变会增加更多的共轭键，从而将荧光激发和发射移至更长的波长，就像黄色荧光蛋白 (YFP) 一样。
3. 电子跃迁
了解激发和发射过程细节的一种有用方法是将该过程呈现为 Alexander Jablonski 在 20 世纪 30 年代首次构想的图表形式。图表左侧是单线态。这些状态保持电子的成对 + ½ 和 − ½ 自旋状态与正常情况相同，成对电子中的每个电子具有相反的自旋。S0 是基态，表示未被光激发的分子的能量。S1 和 S2 是激发单重态，其中外层电子被提升到不同的轨道。S2 包含的能量比 S1 多，而 S1 包含的能量比基态 S0 多。图右侧是三重态，其中外层电子被提升到新轨道，随后也经历了自旋反转，因此之前的一对电子现在平行。根据量子理论，电子不能处于除成对电子中存在的两个自旋状态（+½ 或 –½）之外的任何自旋状态；因此，电子要反转自旋，必须经历“禁忌”跃迁，这相对不太可能。尽管如此，电子仍可以在单线态和三线态之间发生“系间窜越”。
4. 激发光谱
当荧光团吸收光时，光子所拥有的所有能量都会转移到荧光团。该能量与光子的波长成反比（E = h × c / λ，其中 h 是普朗克常数，c 和 λ 分别是真空中光的速度和波长）。如果吸收的光子能量大于从基态精确跃迁到 S1 最低能级所需的能量，分子也会发生振动、旋转和/或移动到更高的电子轨道 (S2) 的变化。因此，有一系列波长可以激发分子。然而，荧光所需的最小能量来自能够导致电子跃迁到更高电子激发态（即 S0 到 S1）的光子。分子从基态跃迁到激发态所需的时间非常短，约为飞秒（大致等于以光速传播的特定波长的光子与分子相遇所需的时间）。虽然一个具有适当能量的光子通常会导致这种转变，但多个光子也可以增加其能量，使分子进入激发态。例如，如果两个能量为达到激发态所需能量一半（即波长两倍）的光子同时撞击分子，它们的能量可以相加并提供双光子激发。
荧光团的激发光谱可以通过测量荧光产量来经验性地确定，方法是将各种波长的光照射到含有荧光团的比色皿上，并记录在荧光光谱的峰值波长处产生的荧光斯托克斯位移光量。激发光谱中的峰和谷反映了分子 Jablonski图中的能级。例如，对于许多分子来说，在 S1 的最高能级和 S2 的最低能级之间只有少数振动或旋转状态，因此对于许多荧光团来说，吸收光谱在与激发到 S1 能级相关的较长波长峰值和与 S2 能级相关的较短波长吸收之间显示出下降趋势。毫不奇怪，考虑到获得激发所需的阈值能量，激发能量在光谱的低能量-长波长侧具有比短波长-高能量侧更尖锐的截止，而短波长-高能量侧没有尖锐的截止；尽管实际上，玻璃对紫外线的光学不透明度限制了荧光显微镜在近紫外线以外的激发。荧光团吸收光子的概率称为其摩尔消光系数ε，单位为M-1cm-1。该属性测量光穿过含有荧光团的溶液时被吸收的概率，类似于（尽管单位不同）染料的“横截面”，这意味着分子可以被想象为目标，横截面越大，它捕获光子的可能性就越大。ε的值是针对吸收最大的波长指定的，即其横截面最大的地方。有用的小有机荧光团的 ε 值介于 ~25,000 和 ~200,000 之间（值越高，吸收效果越好）。所谓的“增强型”GFP (EGFP) 的激发最大值移至 488 nm，ε 约为 60,000，比激发最大值为 470 nm 的野生型 GFP 高五倍。当需要将光强度保持在最低水平时，例如对活体组织进行成像或荧光团分子很少时，消光系数高的染料往往很有用。在其他条件相同的情况下，对于相同量的光诱导背景，消光系数较高的染料也会比消光系数较低的染料产生更大的信号。
5. 发射光谱
一旦被激发，分子就会使用几种不同的途径最终失去吸收的能量并返回基态。“内部转换”是电子轨道状态（例如 S2 到 S1）之间的转换。严格地说，内部转换允许从一个电子状态的低振动能量到较低电子状态的高振动模式的等能转换，因此在此转换过程中不会损失任何能量，但多余的能量最终会通过振动弛豫而释放。在振动弛豫过程中，荧光团中的振动能量通过直接相互作用转移到附近的分子。在水性介质中，水可能是能量接收者。值得注意的是，振动弛豫不会导致任何发射的光子。内部转换和振动弛豫需要皮秒的时间，通常会将分子带回到S1的最低能级。内部转换有时会将激发的分子完全转换为基态S0，但对于大多数荧光团而言，基态振动模式和第一个单重激发态之间的能量差异足够大，因此这种路径不是首选。激发的分子现在具有与基态类似的振动状态，但外层电子轨道仍包含额外的能量。
在良好的荧光团中，返回基态的首选最终能量路径是排出一个光子，该光子的能量覆盖了 S1 的最低振动状态和 S0 的任何一个振动或旋转状态之间的间隙。荧光团的发射光谱只是该发射光子可以具有的波长范围。该光谱可以通过激发荧光团（通常在其峰值吸光度波长处）并使用设备测量荧光光谱来经验性地确定。考虑到非辐射下降到 S1 的最低水平，发射光的波长与激发光的特定波长无关；因此，不能通过改变激发光的颜色来改变发射光谱。在大多数情况下，发出的发射光也与激发光子的入射方向无关，因此光子可以以与入射光子相反的方向发射，如下面描述的标准落射荧光显微镜中的情况一样。由于发射从 S1 的最低能级开始，因此发射光子的能量通常小于吸收光子，因为振动弛豫和内部转换会去除多余的能量——这是斯托克斯位移的起源。斯托克斯位移的幅度因荧光团而异。通常，大的位移具有更容易分离激发光和发射光的优势。但并非所有荧光发射都发生在比激发光更长的波长上。通常少数基态荧光团在被激发时处于 S0 的较高振动状态之一。在这些情况下，光子可以以比达到 S1 所需的更大的能量跃迁回落，这解释了发射和激发光谱的重叠。更严重的重叠问题涉及在同一样本中对多个荧光团进行成像。鉴于每个荧光团的激发和发射光谱较宽，即使是光谱偏移的荧光团也可以被相同波长激发并表现出重叠的发射。
这些重叠可能导致同一样本中不同荧光团相关信号之间产生令人困惑的串扰或渗透。通过有机合成更宽光谱范围的荧光团（通过添加更多共轭键），这一困难得到了改善，现在允许用户选择激发和/或发射光谱重叠较小的荧光团。然而，串扰仍然是荧光蛋白的一个严重问题，因为荧光蛋白相对于小的有机化学荧光团具有非常宽的激发和发射光谱。在这里，新的波长偏移变体也可能起到拯救作用。虽然转移到更长的波长，但发射荧光的光谱与吸收光光谱的主要部分具有镜像对称性。这种对称性与从 S1 的最低振动状态最终回到基态有关。回到基态的振动跃迁与吸收期间发生的振动跃迁相同。在每种情况下，分子通常从“0”振动状态开始，然后移动到相同或更高的振动状态，例如 0、1、2 或 3。这些振动跃迁在任一方向上具有相同的可能性。例如，S0 能级 0 到 S1 能级 3 的可能性与 S1 振动能级 0 到 S0 能级 3 的可能性相当。因此，吸收峰和发射峰相同，但发射波长更长。了解荧光团的吸光度和发射光谱有助于确定哪种滤光片是最佳的、以及如何最好地激发一种染料而不会受到另一种染料的干扰。
6. 系统间交叉
不幸的是，荧光发射并不是激发态荧光团损失能量的唯一途径。另一种能量损失途径是在系统间交叉后通过禁忌跃迁到三线态。在许多荧光团中，三线态振动能级与 S1 中的最低能级重叠。这种重叠有利于系统间交叉，然后内部转换为 T1 的最低能量。三线态分子现在没有简单的路径回到较低能量的单线态基态，因为这种跃迁需要三线态外电子再次经历禁忌跃迁。虽然一些三线态分子在没有光发射的情况下达到基态，但在许多情况下确实会发生称为磷光的光发射，但它可能需要几微秒的时间，因为它取决于不太可能发生的禁忌跃迁。同时，如果另一个光子被吸收，三重态-三重态跃迁可以将分子移动到更高的三重态，从而进一步延迟任何光发射。在激光扫描显微镜中，荧光是从一个点到下一个点快速连续测量的，磷光光子的延迟通常太长，无法将其计入正确的像素，从而削弱了荧光信号。此外，由于三重态的分子无法快速循环吸收和发射，因此该状态会暂时将潜在的荧光分子从总池中移除。最后，也许是最成问题的问题是，三重态分子可能发生光化学反应，导致不可逆的漂白和光毒性。
7.量子产率和荧光强度
荧光团的量子产率是整个荧光光谱范围内总光发射的量度。它是荧光发射与非辐射能量损失之比。对于非常强的光源，例如激光扫描显微镜中使用的激光器，量子产率可以精确测量荧光团可以获得的最大强度。对于较暗的光源，强度主要取决于消光系数和量子产率的乘积。荧光素等荧光染料的量子产率较高，约为 ~0.9，而 GFP 的量子产率约为 0.8。更高的量子产率不仅会增加荧光强度，还意味着与系统间交叉相关的替代竞争光化学过程（例如漂白和自由基形成）不太可能发生。除了尝试使用染料进行光化学反应的情况外，量子产率越接近 1 越好。例如，伊红是荧光素的溴化衍生物，其量子产率是荧光素的五分之一，但其三线态与氧相互作用产生的反应中间体（单线态氧）的产率是荧光素的 20 倍。曙红激发可用于将二氨基联苯胺光转化为电子致密产物，以标记电子显微镜工作的荧光位点。
8. 激发态寿命、能量转移和光化学
分子在产生光子之前保持激发状态的时间称为激发态寿命。该时间主要由分子在 S1 最低能级所花费的时间决定，通常在自发衰变到基态之前几纳秒。如果附近的另一个分子可以吸收能量，则可以缩短寿命。这种分子间相互作用既缩短了荧光寿命，又降低了量子产率。荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 探测荧光分子附近环境的变化，因此是研究荧光标记分子与其相互作用伙伴之间分子相互作用的重要工具。如果相互作用伙伴本身就是荧光团，则激发态分子中的能量可以激发附近的荧光团。这种现象称为荧光共振能量转移 (FRET)，发生在非常近的荧光团的吸收光谱与激发荧光团的发射光谱重叠时。供体的能量被受体吸收，然后受体发射出一个波长更长的光子。这种能量转移对距离的强烈依赖性使 FRET 能够测定远低于光学显微镜分辨率的分子内距离变化。
激发态分子还可以参与各种光化学反应。例如，光解笼锁在生物学中被广泛用于在光诱导释放阻断基团后释放生物活性化合物。一些荧光蛋白的结构和光谱特性也会随着光而发生变化。值得注意的是，珊瑚中的荧光蛋白 Kaede 中的红色发色团是由这种蛋白质的绿色形式产生的，该蛋白质通过暴露于紫外线而转化。
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生理荧光团 ✦
目前，有许多探针通过积累在细胞器（如线粒体、内质网、细胞核或突触小泡）中来检测生理过程的某些方面。荧光团的开发也利用了荧光团的吸收和发射特性对变化的环境高度敏感这一事实。荧光传感器在与钙离子 、氢离子或其他感兴趣的分子结合时会改变其吸光度和/或发射光谱。尽管许多传感器只能通过简单的荧光增加或减少来估计其目标浓度的变化，但其中一些荧光团可用于“比率”测定，从而提供定量测量浓度的方法。通过计算染料在两个发射或吸收波长（一个波长对目标分子敏感，另一个波长对目标分子不敏感）下的行为比率，可以对与目标浓度变化无关的变化进行标准化，例如穿过细胞的距离、不均匀环境或局部染料浓度，这些变化可能会导致局部吸光度或发射强度因所研究分子局部浓度变化以外的原因而变化。正确进行比率成像需要充分了解测量误差的来源以及计算方法。幸运的是，有许多关于这种强大的定量技术的优秀综述。监测钙和各种其他细胞内信号的遗传编码荧光探针正在迅速发展，并开始为完整系统中的细胞内代谢提供窗口。一些染料对电场敏感，因此，当它们位于分隔两个不同电位的隔间的膜中时，它们可以提供跨膜电压的光信号。通过与电压敏感离子通道耦合来感知膜电位的荧光蛋白提供了未来在活体动物中同时监测许多神经元的神经活动的可能性。显然，生理功能的荧光指标的进化是现代细胞和分子生物学的胜利之一。然而，使用它们的关键点需要观察时间和空间。这种多维成像需要高效的探测器，有时还需要快速切换滤光片，并克服活细胞成像的诸多挑战。
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荧光显微镜 ✦
鉴于斯托克斯位移，很容易想象如何构建荧光显微镜：用一种波长照射样本，然后过滤返回光，只看到较长波长偏移的荧光。
事实上，这与乔治·加布里埃尔·斯托克斯爵士首次注意到荧光的方式类似：据称，紫色彩色玻璃窗将阳光过滤到奎宁水烧瓶上，然后他观察到，奎宁水通过装满白葡萄酒的玻璃杯发出蓝光，白葡萄酒阻挡了紫光。现代荧光显微镜的首选方法是落射照明。在这种配置中，显微镜物镜不仅具有对样本成像和放大的熟悉作用，而且还充当照亮样本的聚光镜。这种方法相对于透射或透射荧光显微镜（其中激发光穿过聚光镜，发射光由物镜收集）的优势在于，虽然荧光团的激发在落射和透射显微镜中是等效的，但在落射照明模式下，只有从样品反射的一小部分激发光需要在返回光路中被阻挡。这种方法的主要技术障碍是激发光和荧光发射在光路中重叠，需要一种特殊的分束器，即二向色镜，将激发光与发射光分开。二向色分束镜设计用于 45° 的光路。在普通荧光显微镜中，二向色镜反射来自光源的较短波长光并透射发射荧光的较长波长。每个二向色镜都设计为具有从反射到透射的过渡，该过渡位于与其一起使用的荧光团的激发和发射峰之间。二向色镜很少在没有两个附加滤光片的情况下使用：激发滤光片，它预选激发波长，以及仅允许较长波长的光通过返回检测器的屏障滤光片。所有这三种类型的滤光片通常都是具有非常特定波长选择性的干涉滤光片。这些是由许多折射率交替变化的薄材料堆叠而成的工程奇迹。有了这三个元素，即激发器、分束二向色镜和屏障，激发光与发射光的分离效果可以非常好。例如，现代滤光片组可能只会将10000个错误激发颜色的光子中的一个传递到样本，而返回光中的比例也类似。如此高的比率对于对少量或单个荧光分子进行成像是绝对必要的。
1. 滤色块
许多荧光显微镜提供了一种方便的方法，即通过由激发器、二向色镜和屏障滤光器组成的小块状滤光器支架来选择与特定荧光团相关的激发和发射的精确波长带。立方体装在一个圆形转盘或线性块中，可以容纳2到8个独立的立方体。这些立方体可以手动或通过计算机驱动的电机移动到位。因此，要在红色荧光团（如 TRITC）、绿色荧光染料（如荧光素）和蓝色荧光染料（如 DAPI）之间进行成像切换，就像从一个立方体移动到另一个立方体一样简单和快速。应该记住一点注意事项。由于立方体不一定完全对齐（尤其是二向色镜的 45° 角），因此不同立方体的图像可能会略有偏移，因此在重叠使用不同立方体拍摄的两幅图像时需要小心。立方体的选择不仅基于与特定荧光团的光谱匹配，还基于它们是宽带还是窄带。宽带立方体试图根据染料的激发和发射光谱为其提供最大的信号。当人们正在寻找来自单一染料的信号并且不担心串扰时，这种立方体是首选。或者，在许多情况下，同一样本中不同荧光团的位置至关重要。在这些情况下，使用窄带立方体很有用。在确定适合特定应用的立方体时，用户必须能够访问荧光团的激发和发射曲线以及立方体三个元素的光谱过滤特性。
2. 光源
传统上，眼睛舒适观看或快速曝光所需的强度来自弧光灯。汞和氙弧光灯价格昂贵，具有潜在危险，需要特殊的灯箱和电源。这两种弧光灯在几个重要方面有所不同。根据您的要求，氙气或汞是更好的选择。氙气的优点是在整个紫外线、可见光和近红外范围内的波长覆盖范围相对均匀。然而，汞是一种光谱峰值光源，具有几条非常强烈的谱线。如果这些谱线与您使用的荧光团的激发光谱相吻合，它会提供更亮的光。汞不是某些比率染料（如 fura 2）的良好光源，对于它来说，两个相邻激发波长之间的信号比较会受到以下事实的干扰：其中一个波长与汞峰重叠，而另一个波长不重叠。考虑到这些例外情况，最强的荧光通常来自 100 瓦汞。这是最亮的光源，因为单位面积的平均光通量最高。因为在科勒式照明中，电弧图像聚焦在物镜的后孔上，所以明亮照明的关键是电弧图像的强度。令人惊讶的事实是，虽然功率（瓦数）更高的电弧会产生更多光，但它们更大，并且需要将其图像缩小到实际尺寸以下才能适合物镜的后孔，而这种缩小会导致图像强度降低。因此，小而高强度的电弧可以提供更强烈的激发光。随着时间的推移，由于阴极和阳极的钝化，电弧将不容易点燃。灯泡也将开始显示强度变化和电弧位置的轻微移动，从而导致闪烁。因此，一旦灯泡达到其使用寿命（汞灯为 200 小时，许多氙气灯为 400 小时），就应更换灯泡。对准也可能出现偏移，导致弧光图像不在物镜后孔径的中心，需要每周左右调整对准。这需要在灯箱上设置一些调整，需要一点练习，但忽略此步骤会导致照明不均匀，并且图像通常会暗得令人无法接受。当将清晰的弧光图像放在物镜后孔径上时，照明最均匀。虽然这个清晰的图像意味着将存在没有光的区域，但这种缺失只会消除样本的一些潜在照明角度。由于荧光发射通常对照明角度不敏感，因此照明角度的不均匀性是不可见的。相反，当电弧未很好地聚焦在后孔上时，样品上各个位置的强度可能会不均匀。这种伪影会导致图像中的荧光更亮或更暗。近些年，这些问题已通过开发与新型超高压 120 W 汞卤灯泡耦合的液体光导得到解决。其中一些系统是专门为荧光显微镜照明开发的（例如，Exfo Photonic Solutions 的 X-Cite 120）。这些灯泡的发射光谱类似于传统的汞弧灯，但由于高压碰撞改变了电弧中激发原子的振动能量，因此具有一些额外的光谱展宽。这种展宽，尤其是在荧光素激发区，使这些灯泡优于传统的汞弧。此类系统虽然价格昂贵，但弧光灯更换间隔时间更长（>1,000 小时 vs. 200 小时），无需将灯箱直接连接到显微镜，方便使用，不存在对准问题，显微镜视野内照明均匀。最近明亮发光二极管 (LED) 快速发展起来，更加轻便、安全，长寿命，易控制等特点将逐渐取代汞灯等光源，成为荧光显微镜的主流光源。
3. 物镜
由于显微镜物镜既是激发标本荧光的光源，又是收集荧光的光学元件，因此其特性对荧光图像有很大影响。重要的是要了解，由于显微镜物镜的设计过去一直以改善明场彩色图像质量的功能为中心，因此人们在校正色差方面投入了大量精力。这些校正对于荧光显微镜专家来说不那么重要，他们通常更关注激发和收集效率、分辨率和对比度。理想的荧光显微镜物镜具有较高的数值孔径 (NA)。物镜的 NA 是一个关键参数，可以在物镜的镜筒上找到。它比放大倍数更重要，因为它既设置了物镜的分辨能力，又设置了光效率。NA 值是通过将“半角”（物镜可以收集的垂直和最大角度射线之间的角度）的正弦乘以物镜和盖玻片之间介质的折射率得出的。半角越大，可以收集的光子数量就越多，可以用来激发样本的光量就越大。因此，通过物镜的激发光量大致与 (NA)2 成正比，同时收集的荧光发射量也与 (NA)2 成正比。因此，观察到的强度与 (NA)4 成正比。此外，油浸透镜（其中的油与盖玻片的折射率相匹配）可防止由于盖玻片的反射和折射而造成的光损失，从而提高激发和收集效率。图像强度也与放大倍数的平方成反比，因此最强烈的图像将来自相对较低的放大倍数。高 NA 还会增加物镜的分辨能力。最小可分辨距离为 0.61 λ / NA。此外，理想的荧光物镜将具有相对较少的透镜元件，以减少由于反射和杂散光眩光造成的损失。理想情况下，透镜元件和胶合剂具有非常低的固有荧光，因此在没有荧光信号的情况下，视野看起来完全是黑色的。最后，理想的荧光物镜将通过紫外线、可见光和近红外中的激发波长。所有这些信息都可以从制造商处获得（尽管需要一些挖掘）。
可以说，专门为荧光显微镜专家的特殊需求而设计的物镜正变得越来越普遍，但没有一种物镜在所有情况下都是理想的。样本较厚的用户可能需要考虑使用具有球面像差校正环的镜头，因为当样本的折射率与盖玻片和物镜之间的材料不同时，这些像差会导致模糊和对比度降低。如果经常处理薄切片，可能需要一个“平面”镜头，该镜头可在样本中成像平坦的视野 - 否则边缘可能会模糊。如果主要目的是在一个样本平面上完美对齐蓝色、绿色和红色荧光材料，则应考虑使用复消色差镜头。在购买之前，最好在自己的样本上试用昂贵的物镜，以确保它能提供您期望的图像。
1. 漂白
①漂白现象
虽然原则上荧光团可以在基态和激发态之间无限次循环，但有机荧光团的使用条件通常会限制循环次数。对于好的荧光团，估计 10000-40000 次循环通常被认为是发生永久漂白之前的极限。漂白是导致荧光信号永久消失的所有过程的统称。另一方面，淬灭是由于荧光团与其分子环境之间的非共价相互作用而导致的可逆荧光损失。上面提到的 FRET 是激发态荧光团碰撞或动态淬灭的一个例子。当基态荧光团与另一个分子（有时是其他相同的荧光团：自淬灭）结合时，会发生静态淬灭。在分子水平上，漂白有几种不同的发生方式，可以说，大多数荧光团的光化学反应都不太好。很明显，长寿命的三线态为具有激发电子的分子提供了比更短的单线态更多的与其他分子相互作用的机会。因此，大多数漂白被认为与三线态有关。漂白中的一个重要因素似乎是三线态荧光团和分子氧之间的相互作用。三线态可以将其能量转移到氧气（氧气本身是基态的三线态），将氧气激发到单线态。单线态氧是一种活性分子，可以参与多种与有机分子的化学反应。这些化学反应可以共价改变荧光团，使其失去荧光能力（即漂白）。此外，单线态氧可以与其他有机分子相互作用，对活细胞造成光毒性。
②漂白的处理
荧光信号不如人们希望的那样明亮，原因有很多，但漂白可能是最严重的。减少漂白的一种方法是使用不超过对样本成像绝对必要的光。如果显微镜在落射照明端口上有孔径光阑，请使用它将光照水平滴定到低值。视场光阑也可以缩小到只照亮一小块区域，以最大限度地减少一般漂白并提高对比度。在固定样本中，漂白量似乎与荧光团经历的激发发射循环次数直接相关，因此昏暗的光线不会自动消除漂白。因此，在不使用时，应始终将含有荧光样本的载玻片存放在黑暗中，因为长时间的环境光会使它们褪色。
重要的是要意识到，具有相似激发和发射光谱的荧光团可能具有截然不同的漂白率。Invitrogen 的 Molecular Probes 或 Sigma-Aldrich 等公司销售新一代荧光团，其光稳定性比荧光素、罗丹明和德克萨斯红等以前众所周知的染料更高。Alexa 染料就是这样一个例子，其漂白速度比旧染料慢几倍。毫不奇怪，新荧光团还有另一个好处；它们的强度很高，因为它们的量子产率很高，因为高效的荧光发射可以抑制分子最终处于三重态的趋势。
不幸的是，即使使用最好的染料，有时也需要使用会导致漂白的强度，例如用相机拍摄图像或长时间延时成像时。对于固定样品，将样品浸入载玻片上，使用旨在减少漂白的封固剂是一种有效的策略。许多抗褪色剂可以在实验室中以相当低廉的价格配制，也可以购买现成的。所有这些都仅适用于固定标本，而固定标本有多种选择。对苯二胺对 FITC 和罗丹明非常有效，但暴露在光线下会褪色，因此载玻片必须存放在黑暗的容器中。此外，它是一种反应性化学物质，需要小心使用以尽量减少接触。DABCO（“Slow Fade”是 Molecular Probes 的商业版本）的效果稍差一些，但具有更高的耐光性和更低的毒性。N-丙基没食子酸酯对于罗丹明来说比前两种更好。此外，还有几种专有的抗褪色封固剂（Vector Labs 的 Vectashield、Molecular Probes 的 ProLong Gold）。
值得强调的是，并非所有染料都同样容易受到所有抗褪色剂的影响。对一种染料效果很好的药剂可能对另一种染料几乎不起作用，而对另一种抗褪色剂则可能相反。所有这些抗褪色封固剂通常都含有水-甘油混合物以及旨在通过减少单线态氧的产生或其寿命来减少褪色的化学物质。水甘油混合物的折射率介于水和油之间。因此，现在有几家公司正在制造物镜和盖玻片之间的浸没介质，以匹配盖玻片另一侧封固剂的折射率。折射率匹配可减轻样本图像中的球面像差。对于活体标本，抗褪色剂仍不完善，尽管抗坏血酸、维生素 C 和 E、β-胡萝卜素和低氧张力可能会提供一些缓解。在所有成像应用中，提供所有或几乎所有发射波长的有效通道的高质量光学滤光片也可以减少漂白。使用具有高量子效率或低噪声的快速胶片或相机可以缩短曝光时间并减少漂白。当然，不会漂白的荧光探针将是最好的解决方案。这个看似不可能的命题现在已经随着量子点的发展而实现。这些复杂的三层纳米晶体使用镉盐半导体作为荧光团的等效物。点的外壳提供了一种方便的化学基质，可以将点附着到生物配体（如亲和素）上。它们具有许多显着的特性，包括巨大的吸收范围和波长，部分基于特定的镉盐，部分基于它们的大小。因为它们可以很小（纳米），所以它们可用于各种标记技术。它们的抗漂白性也使它们成为单分子检测的理想选择。
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总结 ✦
荧光用于探测生物现象的应用正在迅速扩展到细胞和分子生物学的所有领域。荧光和荧光团背后的光物理和化学原理似乎与生物学相去甚远，但理解它们是良好荧光显微镜的核心。此外，许多新模式，如共焦、多光子、受激发射损耗 (STED)、结构照明、全内反射荧光 (TIRF)、FRET、FLIM、光漂白后荧光恢复 (FRAP) 和荧光相关光谱 (FCS)。最后，用于监测活细胞活动的荧光蛋白基因工程是了解生物学最有力的新窗口之一。因此，在可预见的未来，生物学和荧光将紧密交织在一起。
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